SSH 技术的原理和方法 |
 SSH 是抑制性 PCR 与消减杂交技术相结合的更简单、更快速的分离差异基因的方法。该方法运用了杂交二级动 |
| 力学原理，即丰度高的单链 DNA 在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链 DNA ，从而使原来在丰度上有差 |
| 别的单链 DNA 相对含量达到基本一致。而抑制 PCR则是利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端 |
| 反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对，从而选择性抑制非目的基因片段的扩 |
| 增。这样既利用了消减杂交技术的消减富集，又利用了抑制性PCR技术进行了高效率的动力学富集。 |
| 第1步:SSH 技术首先将由 mRNA 逆转录来的检测子cDNA(Tester)和驱动子cDNA(Driver) 分别用同一种识别四碱 |
| 基序列的限制性内切酶 RsaⅠ消化形成平均长度大于500bp的cDNA片段，这样可增加有差别表达基因检出的可能性， |
| 以防止长链片段形成的复杂结构对消减杂交的干扰。 |
| 第2步:连接接头(Adaptor)。将 Tester cDNA 均分为两份，分别接上接头Adaptor 1 和Adaptor2. Adaptor 设 |
| 计十分巧妙，由一长链 (40 nt) 和一短链 (10 nt) 组成的一端是平端的双链 DNA 片段，且双链 5' 端均无磷酸化 |
| 基团，保证了Adaptor 以惟一方向与 cDNA 片段连接。接头外侧序列与第1次 PCR 引物序列相同，而内侧序列则与 |
| 第 2 次 PCR( 巢式PCR) 引物序列相同，有利于后续 PCR 的筛选扩增。此外接头上含有Ｔ7 启动子序列及内切酶识 |
| 别位点，为以后克隆和测序提供方便。 |
| 第3步:两轮消减杂交。用过量 Driver cDNA 样品与上述两份连有接头的 Tester cDNA 样品进行第 1 次消减杂 |
| 交，分别得到4种产物。这种不充分杂交使得单链 cDNA 分子在浓度上基本相同。同时由于 Tester cDNA 与 Driver |
| cDNA 序列中相同片段大都形成异源双链分子 c ，使得 Tester cDNA 中差异表达基因得到第一次富集；然后混合上 |
| 述两份杂交样品，同时加入新的变性 Driver cDNA 进行第 2 次消减杂交。此次杂交只有第1次杂交后经扣除和丰度 |
| 均等化的单链Tester cDNA 能与 Driver cDNA 形成双链分子。这一次杂交进一步富集了差异表达的cDNA，并且还形 |
| 成了2个 5 '端分别接不同接头的双链分子e。 |
| 第 4步:两次 PCR 反应。5' 端填平末端，加入根据接头设计的引物进行两次 PCR。第1次PCR基于抑制反应，只 |
| 有两端连接有2个不同接头的双链 cDNA 片段 (如ｅ) 才能得到指数扩增。第2次 PCR 实际上是巢式 PCR，极大地提 |
| 高了扩增特异性，使差异表达的目的基因片段得到大量富集。然后利用接头上存在的酶切位点，插入适当载体，转 |
| 化细菌，初步筛选出具有插入的克隆，再经杂交筛出具有差异表达的克隆，进行测序、同源分析等系列工作，最后 |
| 完成全长基因的克隆、鉴定 。 |
抑制性消减杂交文库技术 |
| 是一种革命性的差异表达基因筛选技术。该方法结合了抑制性PCR和消减杂交技术，即御用PCR反应链内退火有 |
| 限于链间退火的特点和分子杂交二级动力学原理，经过体系不断优化建立起来的快捷、有效的差异基因筛选方法。 |
| 与传统的DD—PCR、SAGE及cDNA—RNA等技术相比，具有低丰度mRNA富集效率高、假阳性低、灵敏度高重复性好等特 |
| 点。现已广泛应用于动植物发育和分化、疾病易感性差异、抗药性差异和组织（病理和正常样本）差异及微生物基 |
| 因分型差异的研究。 |
 技术方法成熟有效 |
| 不需要利用传统的物理方法对单链、双链cDNA进行分离。只要目的序列存在，就能进行指数扩增，筛选出差异 |
| 基因片段。 |
| 放大稀有转录本 |
| 本技术在同一操作下完成转录本丰度平衡和差减，在我们的模型实验中，稀有转录本至少被放大了5000倍，也 |
| 就是说用本及时可以极大地增加获得表达差异地稀有转录本地可能性。 |
| 仅仅需要500ng的poly A＋ RNA |
| 与其他的消减杂交方法不同，应用抑制性消减杂交技术只需要0.5－2的poly A+ RNA即可进行有效实验。如果您 |
| 只有极少量（50ng-100ng）的总RNA，我们可以通过poly A＋ RNA的高保真线性放大技术来合成足量的cDNA来进行抑 |
| 制性消减杂交实验。 |
SSH消减流程图 |
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